發光免疫類檢測試劑注冊技術審查指導原則（食藥監辦械函[2013]3號）

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發光免疫類檢測試劑注冊技術審查指導原則
（食藥監辦械函[2013]3號）

一、前言

本指導原則主要針對發光免疫類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對發光免疫類檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

該指導原則主要適用于利用發光免疫分析技術對蛋白質等被測物質進行檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術審查，第二類試劑的生產及質量控制可參考該指導原則執行

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產用的各種原料、輔料應當制定相應的質量標準，并符合有關法規的要求。

2.診斷試劑的生產企業應具備相應的專業技術人員、儀器設備以及適宜的生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》;同時，生產企業應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行;生產企業還應該通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。企業應對試劑的使用范圍做出明確規定，并經國家藥品監督管理部門批準。

3.診斷試劑的研制應當按照科學、規范的原則組織研發，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

4.研制生產過程中所用的材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.試劑生產和質量控制的總體目標：保證產品使用安全，質量穩定，工藝可控，使用有效。

（二）原材料質量控制

1.主要生物原料

與產品質量最密切相關的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。一般按工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定;若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：

（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒;或者為白色粉末，不含其他顏色雜質;特殊生物原料應具備相應外觀標準。

（2）純度和分子量

主要經SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳。一般每個電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質量標準，分子量大小應在正確的條帶位置。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲方法等進行檢測。

（4）效價

效價的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料、主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白等。這些生物原料的質量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質控標準》規定的標準要求，并且要適合于本企業的生產。

建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物

無菌試驗：將血清直接37℃度放置7天，放在明亮處觀察，不得出現混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結塊，無肉眼可見的其他雜質顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18~26℃時，溶解時間應不大于15分鐘。1%牛血清白蛋白水溶液的pH值應為6.5~7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲方測定，質量標準為≥95%。

總蛋白中的BSA含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量，其標準為≥90%。

（3）酪蛋白：

酸度應符合生產所需的質量標準。

（4）標記用酶

應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢驗方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD_403nm/OD_280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行測定，均不得出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。

3.化學原材料

化學原材料的質量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、重金屬檢測、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業的生產。

（1）無機類：主要包括有氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氯鈉等。

（2）有機類：主要包括有吐溫20、三羥基氨基甲烷等。

（3）特殊化學原料：銪-DTTA，魯米諾等。

銪-DTTA純度分析與鑒定：要求銪-DTTA各功能團符合分子結構，純度在96%以上。

4.其他原輔料

（1）微孔板條

外觀：明亮處用肉眼觀察板條的外觀質量應無劃痕、破損、飛邊、骯臟、表面光滑。板條與微孔反應條塑料框架應配合合適。

材質：微孔反應板條每孔加200μL增強液，用發光免疫分析儀檢測其熒光值，平均本底熒光值≤1500。

吸附能力和精密性：用一定濃度的蛋白包被微孔板條，檢測熒光值，CV值結果應符合相關產品的功能性質量標準，一般批內CV≤5%,批間CV≤10%。

（2）其他

粘膠紙、鋁箔袋、說明書、包裝外盒、瓶子和干燥劑等應參照國家食品藥品監督管理局發布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質量控制標準。

（三）試劑盒各組分的生產

發光免疫分析試劑主要組分的生產包括包被反應板、標記物制備、各種溶液的配置、凍干、分包裝等步驟;并通過產品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質控過程來保證其質量符合規定。

1.固相載體的制備（因不同產品使用的包被載體有很大區別，在此以標準96孔微孔反應板為例進行描述）

（1）包被板的準備

準備經檢驗合格的包被板，記錄批號、數目、狀態標識。

質控項目：尺寸、外觀、包裝。

（2）包被液的配制

配制包被緩沖液，加入包被的抗體或抗原至工作濃度，混合均勻，即成所需的包被液，工作濃度的包被液應在規定時間內使用。

質控項目：包被緩沖液配方、pH值、包被物成分。

（3）包被板的包被

包被液按工藝要求加入包被板。記錄所包被的包被板數量。

質控項目：包被體積、溫度、時間、過程監控。

（4）洗板工作液的配制（按各單位工藝要求，可以不洗板）

按配方配制洗板工作液。

質控項目：洗板工作液配方、pH值。

（5）封閉液的配制

按配方配制封閉液。

質控項目：封閉液配方、pH值。

（6）洗板和封閉

包被完成后，抽去孔內包被液，用洗板工作液洗板后（按各單位工藝要求，可以不洗板），加入封閉液。

質控項目：封閉體積、溫度、時間、過程監控。

質檢項目：封閉前檢驗包被均一性。

（7）抽干

封閉后的反應板，抽干孔內液體。

質控項目：過程監控。

（8）干燥

反應板應按工藝的要求進行干燥。

質控項目：溫度、濕度、時間、過程監控等。

（9）密封包裝

將干燥后的反應板用鋁箔袋密封包裝，內放干燥劑（按各單位工藝要求，可以不放）。

質控項目：密封性能、標示及效期等。

（10）反應板（半成品）檢驗

對裝袋密封后的反應板進行抽樣檢驗，外觀、板內變異、板間變異。

2.滴配過程

（1）酶結合物的制備（根據各產品實際情況，該步驟可不進行）

采用常規過碘酸鈉——乙二醇法將相關的抗體（或抗原）標記辣根過氧化物酶（或其他酶），酶標記后的抗體（或抗原）應加入適當的保護劑保存于低溫。

質控項目：標記方法、過程控制。

（2）酶結合物的鑒定

①功能性實驗

將酶結合物用酶稀釋液稀釋后，用于產品的滴配，其結果應符合相關試劑盒的質量標準。

② 穩定性

將酶結合物用酶稀釋液稀釋，進行2~8℃熱穩定性實驗，滴配結果應符合相關試劑盒的質量標準。

（3）酶結合物稀釋液

按酶結合物稀釋液的配方配制，存放在2~8℃保存，并于規定時間內使用。

質控項目：酶結合物稀釋液配方、pH值。

（4）酶結合物工作濃度的滴配

取酶結合物，用酶結合物稀釋液稀釋到不同的濃度，用已制備好的反應板進行滴配。測定系列標準品及相應的質控品，確定使體系達到最優的酶結合物工作濃度。

（5）酶結合物工作液配制

將所需量酶結合物和酶結合物稀釋液按滴配濃度混合均勻。

質檢項目：分裝前檢驗，用配套的反應板進行檢驗，外觀、靈敏度、質控品測定值、定量產品應作校準品線性檢測。

（6）酶結合物工作液的分裝

按工藝要求分裝酶結合物工作液。

質控項目：分裝前確認試劑名稱、批號、數量，分裝量，封裝后密封性。

（7）酶結合物工作液（半成品）檢驗

對分裝后的酶結合物工作液進行抽樣檢驗，外觀、分裝量、靈敏度、校準品劑量-反應曲線線性、質控品測定值。

3. 校準品、陰/陽性對照或質控品的制備

（1）稀釋液

按稀釋液的配方配制，存放在2~8℃或-20℃保存，并于有效期內使用。

質控項目：稀釋液配方、pH值。

（2）校準品、陰/陽性對照或質控品的配制

校準品、陰/陽性對照或質控品的配制應具有量值溯源性，可參照國家標準品、世界衛生組織標準品或其他級別的標準物質進行配制。

質檢項目：分裝前檢驗，準確性、劑量-反應曲線線性（定量產品）、質控品測定值。

（3）校準品、陰/陽性對照或質控品的分裝

按工藝要求分裝校準品、陰/陽性對照或質控品。

質控項目：分裝前確認試劑名稱、批號、數量，分裝量。

（4）校準品、陰/陽性對照或質控品（半成品）檢驗

對分裝后的校準品、陰/陽性對照或質控品進行抽樣檢驗，外觀、分裝量、準確性、劑量-反應曲線線性（定量產品）、質控品測定值。

4.化學發光底物的制備

（1）底物緩沖液

按底物緩沖液的配方配制，存放在2~8℃保存，并于有效期內使用。

質控項目：底物緩沖液配方、pH值。

（2）化學發光底物（氧化劑和發光劑）的配制

分別按氧化劑和發光劑的配方在底物緩沖液中加入相應的氧化劑和發光劑

質控項目：氧化劑和發光劑配方。

質檢項目：分裝前檢驗，本底、發光強度。

（3）化學發光底物（氧化劑和發光劑）的分裝

按工藝要求分裝化學發光底物（氧化劑和發光劑）。

質控項目：分裝前確認試劑名稱、批號、數量，分裝量，封裝后密封性。

（4）化學發光底物（半成品）檢驗

對分裝后的化學發光底物進行抽樣檢驗，外觀、分裝量、本底、靈敏度、發光強度。

5.銪標記物的制備

針對不同的標記生物原料，確定不同的標記制備工藝，包括銪-DTTA與標記生物原料的比例，標記溫度和標記時間、標記得率的計算標準等。在實際操作過程中要求嚴格按照標準操作規程進行操作

6.凍干

各種凍干品都需建立各自的凍干工藝，凍干品外觀應該呈現疏松的粉末狀固體，具有一定的形狀，復溶完全、迅速，呈澄清透明液體。

7.分裝、燈檢和貼簽

分裝量用減重稱量法進行測量，把質量換算成體積后進行分裝量的控制。燈檢是目測檢查各組分的色澤、分裝量以及是否混濁、有雜質等。

8.包裝

根據試劑盒包裝標準操作規程及說明書的要求，以流水線操作形式進行包裝。包裝時應嚴格檢查品名、批號、裝量，認真核對各物料數量，并在關盒前進行復核。

（四）質量控制

1.半成品質量控制

（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規定數量的半成品各組分，作號標記、待檢。

（2）質控品的要求

用于半成品質量控制的質控品包括陰/陽性樣品符合率、靈敏度（最低檢出量）、特異性、檢測范圍、定量曲線的線性、精密性、穩定性等指標，如具有國家標準品或參考品的產品應使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化的企業參考品進行檢驗。如無國家標準品（參考品），可采用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（3）半成品檢驗

根據各個試劑盒的企業標準或者制檢規程進行半成品的檢驗，檢驗指標一般包括準確性、靈敏度、特異性、精密性、相關性等，均應達到相應的質量標準。

企業應對每一批試劑的半成品進行穩定性研究。試劑盒各組分應留樣，2~8℃定期作穩定性考核，同時作37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

2.成品質量控制

（1）成品抽樣

產品包裝完成后，質檢人員根據試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批發光免疫類檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

（2）成品檢驗

一般使用國家標準品（參考品）對成品進行檢驗，并達到國家標準品（參考品）的質量要求。若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

在批放行前，每一批發光類診斷試劑應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

四、名詞解釋

發光免疫類檢測試劑：根據特異性抗原抗體反應等生物學原理，利用發光信號的強弱對樣本中相應抗原或抗體進行定性或定量檢測的一類試劑。主要包括化學發光（酶促、非酶促），電化學發光和時間分辨熒光等法。

五、參考文獻

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社